ATHEER

السلام عليكم ورحمة الله وبركاته

ورقة بحثية ممتازة اطلعت عليها مؤخرا، بعنوان:

ARE-mediated decay controls gene expression and cellular metabolism upon oxygen variations

منشورة فيه Nature Scientific Reports  بتاريخ 26/03/2018  من جامعة بروكسل الحرة.

أكثر ما أعجبني في هذا البحث هو قواعد البيانات المستخدمة، وهي مهمة، لذلك أرغب بتوثيقها هنا.

____________________________________________________________________

اهتمامي بهذا البحث نابع لكوني أدرس بروتينات لها القدرة على الارتباط بمنطقة موجودة في عدد كبير من الـ mRNAs تسمى (AU-rich element (ARE، وارتباط البروتينات بهذه المنطقة يحفز تكسر الـ mRNAs بعملية تسمى (ARE-mediated decay (AMD.

معلومات إضافية عدم قراءتها لن يؤثر على فهمك للمقالة:

بعض الـ mRNAs تحتوى على ما يسمى بـ  (AU-rich element  (ARE في الـ 3′- Untranslated region. هي عبارة عن منطقة تحتوي على 50-150 نيوكليوتيد، وكما يوحي الاسم، غالب النيوكليوتيد فيها من نوع A & U.

غالبا يحتوي الـ mRNA على هذا الترتيب الخماسي AUUUA المكرر، وتم تصنيف الـ AREs إلى نوعين، بناء على عدد تكرار هذه المجموعة (AUUUA) وتوزيعها في الـ mRNAs، وصنفوا نوع ثالث لا يحتوي على هذا التكرار مطلقا، إنما فقط مناطق غنية بالقواعد النيتروجينية A&U.

هذه المناطق التي نرمز لها بـ AREs تُعد مكان لإرتباط بعض البروتينات فيها (AUBP) وغالبا هذا الارتبطا يؤدي لتكسر الـ mRNA عبر عملية نسميها AMD (من المهم التنويه على أن هذه العملية تعتبر من العمليات الرئيسية المهمة لتنظيم التعبير الجيني). هذه العملية هي تكسر الـmRNA عبر deadenylation-dependent pathway وهي عبارة عن خطوتين:

1. Exonucleolytic removal of the poly(A) tail.
2. mRNA body degradation either by decapping followed by 5′ → 3′ degradation, or by continued exonucleolytic degradation in the 3′ → 5′ direction.

في هذا البحث تم التركيز على بروتين dTIS11 الذي ينتمي لعائلة TIS11/TTP في ذبابة الفاكهة، هذا البروتين له القدرة على الارتباط بـ ARE-containing mRNAs وتحفيز عملية AMD. رغِِب الباحثين بدراسة تأثير نقص الأكسجين الحاد “Hypoxia” على هذا البروتين، وعلى عملية الـ AMD، وبالتالي على الجينات التي يعمل بروتين dTIS11 عليها.

نتائج الدراسة التركيز على القواعد البيانية المستخدمة + التجارب والأجهزة المميزة:

1- تم تعريض خلايا ذبابة الفاكهة S2 إلى نقص الأكسجين الحاد (تركيز 1%) لمدة 18 ساعة، ثم رصد  التعبير الجيني لبروتين dTIS11 . بشكل عام، نقص الأكسجين يسبب نقص كبير في الطاقة ATP وبالتالي توقف العمليات التي تستهلك كمية طاقة كبيرة، ومنها عملية تصنيع البروتين mRNA translation، وهذا أيضا ينطبق على بروتين dTIS11، مستوى الـ mRNA لم يتغير، بينما مستوى البروتين قل بشكل كبير جدا مما يعكس التكسر السريع للبروتين، وتوقف عملية الـ translation.

These results reveal that dtis11 expression is strongly and dynamically regulated by oxygen concentration, thereby suggesting that dTIS11-dependent AMD may contribute to gene expression reprogramming upon variations in oxygen levels.

2- عمل مسح كامل للـ mRNA في حالة نقص الأكسجين في الخلية (1%)، وفي الحالة الطبيعية (21%)، مع تصنيفها بحسب الـ ARE-score لمعرفة الـ mRNAs المعرضة لـ AMD:

* هذه هي الجزئية المهمة جدا في الورقة بالنسبة لي.

-> تم تعريض مجموعة من خلايا S2 لمستوى أكسجين ناقص (1%) و مجموعة لمستوى طبيعي (21%).

-> بعد 18 ساعة تم استخلاص كل الـ mRNA في الخلايا، وعمل RNA-seq، ووجدوا أن 695 جين كانوا مرتفعين في حالة نقص الاكسجين مقارنة بالخلايا الطبيعية، و 456 جين انخفض تعبيرهم الجيني.

-> الآن يرغبون بتصنيف هذه الـ (mRANs (transcripts بناء على وجود الـ ARE motifs فيها، تم حساب الـ AREScores لكل الجينات هذه، ولكل الـ isoforms المسجلة في NCBI RefSeq mRNA database !!

السؤال: ماهو الـ AREScore؟ كيف يعمل، وكيف يُحسب؟

الجواب: هي عبارة عن أداة تم تصميمها من قِبل مجموعة باحثين في مركز أبحاث السرطان الألماني بالتعاون مع باحث من معهد المعلوماتية في جامعة LMU في ألمانيا. أُطلقت رسميا في عام 2012.

فكرتها أنه بعد إدخال mRNAs sequences يخرج لك البيانات على هيئة نقاط رقمية (مثلا 1 أو 2..إلخ)، لكل Transcripts، ولكن، كيف يحسبون هذه النقاط؟

هذه الصورة توضح الحسبة:

الـ Total score هي مجموع:

1- عدد الـ AUUUA pentamer في الـ mRNA.

2- موقع الـ AUUUA pentamer (كلما كانوا متقاربين، حازوا نقاط أكثر).

3- موقع الـ AU-blocks ( هل الـ AUUUA pentamer  موجود في مواقع غنية بالـ AU nucleotides؟) إذا نعم، أضِف نقطة!

4- طول الـ 3′-UTR. الـ AREScore تُحسب في حال كان طول هذه المنطقة اكثر من أو تساوي 10nt.

طبعا بإمكان المستخدم يعدل ويغير من هذه المعايير حسب احتياجه ورغبته.

هذا هو رابط موقع الأداة: http://arescore.dkfz.de/arescore.pl

 ______________

نعود الآن للبحث، استخدموا هذه الاداة لتصنيف كل الجينات بحسب الـ AREScore، طبعا اعتمدوا على أنه عندما تكون قيمة الـ AREScore ≥ 2  وقتها تُعد منطقة الـ ARE قابلة لأن ترتبط البروتينات بها وتحفز الـ AMD، أقل من 2 تعتبر mRNAs غبر معرضة لعملية AMD.

الآن، أصبح لدينا مجموعتين من الجينات، أحدها مع AREScore≥ 2 والأخرى AREScore <  2، صنفها الباحثين أكثر  بناء على ارتفاع/ انخفاض التعبير الجيني أثناء نقص الأكسجين، والنتيجة:

الملاحظة المُستنتجة:

• أكثر الجينات التي ارتفع التعبير الجيني لها في حالة نفص الأكسجين تتبع لمجموعة AREScore≥ 2.

بقدرتنا الآن تحليل هذه المعلومات، علما أن التحليل لا يعني الصحة، إنما هو نتيجة ربط البيانات السابقة ببعضها، واستنتاج مبدئي يحتاج لتجارب عملية لتثبيته واقعيا:

قلنا أن منطقة الـ ARE يرتبط بها بروتينات مثل dTIS11 ويعملون على تحفيز تكسرها عبر عملية تسمى AMD، وعندما يكون الـ AREScore أكبر أو يساوي 2، يعني أن للبروتينات القدرة على الإرتباط، وبالتالي تفعيل AMD.

وقلنا سابقا أيضا أن dTIS11 انخفض بشكل كبير جدا أثناء نقص الأكسجين.

وقلنا أخيرا أن كثير من الجينات التي تحتوي على ARE ارتفع التعبير الجيني لها أثناء نقص الأكسجين.

كل هذا يدفعنا لاستنتاج أن البروتين dTIS11 كان يعمل على هذه البروتينات ويحفز تكسرها في حالة الأكسجين الطبيعي، ولكن عند نقص الأكسجين، ونقص عدد هذا البروتين، استقر التعبير الجيني لهذه الجينات وارتفع.

ولاختبار هذا الإستنتاج، ننتقل إلى التجربة الثالثة التي تمت في هذا البحث.

3- في هذه التجربة رغب الباحثين في معرفة ما إن كان الإنخفاض في التعبير الجيني لـ ARE-containing mRNA بعد الـ reoxygenation كان بسبب بروتين الـ dTIS11 أم لا (بسبب تحفيزه لعملية AMD).

لمعرفة ذلك، صمم الباحثين Crispr-Cas  يستهدف جين dTIS11 لتثبيطه، والبيانات النهائية لهذه التجربة تفيد أن بعض الجينات ارتفع تعبيرها الجين حينما تم تثبيط dTIS11. أيضا، وجدوا أن هذه الجينات تلعب دورا في العمليات الأيضية، وبالتالي dTIS11 بدوره يعتبر بروتين منظم مهم لعمليات التكيف الأيضية استجابة للتغير في مستوى الأكسجين في الخلية.

يهمني أكلمكم عن البرنامج/الموقع اللي استخدموه لتحليل بيانات الـ RNA-seq والتغير في التعبير الجيني، وأيضا باستخدامه صنفوا الجينات حسب الوظائف، ورسم لهم MA plot و MDS plot وأشياء كثيرة بعضها ما اكتشفتها حتى الآن، لكن واضح أنه متعوب عليه، هذا الموقع يسمى Degust، لكن ما تقدرون تستخدمونه فعليا إلا لو عندكم بيانات من جهاز RNA-seq لأن عمله ببساطة هو تحليلها، للفضوليين مثلي، الموقع أعطانا تجربة، صفحة فيها بيانات وممكن تحوس فيها ليين تتعلم وتعرف، بصراحة عمل جباااار، هنا الموقع الرسمي:

http://degust.erc.monash.edu/

وهنا التجربة:

http://degust.erc.monash.edu/degust-old/compare.html?code=example

_______________________

الورقة ما انتهت، فيها تفاصيل أكثر، والبحث مب سهل أبدا، الباحثين عملوا على فكرتهم من جهات كثيرة، لكن نقلت هنا المهم واللي أنا شخصيا بأحتاج أرجع له أكثر من مرة.

هنا ملخص مناقشة الورقة “بالإنجليزية”:

1. dTIS11 protein level significantly decreased upon hypoxia, due to overall mRNA translation blockade (as ATP level decreased) as well as protein degradation by ubiquitin-independent degradation by the 20 S proteasome.
2. The response of hypoxia-tolerant systems to oxygen deprivation occurs in two phases that can be considered as defense and rescue processes. The first lines of defense against hypoxia include a balanced suppression of ATP demand and ATP supply pathways; this regulation stabilizes adenylate concentrations at new steady-state levels as ATP turnover rates greatly decline. Energy-consuming processes such as ion pumping and protein synthesis are down-regulated. The latter process results from a rapid and massive polysome disassembly leading to a translational arrest. Te secondary rescue mechanisms include adaptation of the metabolic program and rely on major changes in the gene expression program mainly under control of the HIF family of transcription factors.
3. “Observations support the idea that dTIS11 controls the AMD of many proteins. However, during hypoxia, and because of dTIS11 absence, many ARE-containing mRNAs are survived and successfully translated, many of these proteins are involved in hypoxia-related metabolic processes and they are important for cellular adaption.”
4. Researchers went far by further studying ImpL3 gene, which encodes lactate dehydrogenase (LDH) in Drosophila, AREScore= 4.1. It’s been shown that this protein is immediately degraded upon reoxygenation in a dTIS11-dependent manner. In dTIS11 deficient cells upon reoxygenation, ImpL3 and LDH accumulate, as so, this will impair the recovery of oxidative phosphorylation and cell proliferation processes. 

5. In conclusion, our study identifes ARE-mediated decay as a new regulatory mechanism contributing to gene expression reprogramming during normoxia/hypoxia transitions and suggests that global inhibition of protein synthesis infuences the expression of specifc gene subsets containing ARE by modulating the level of the post-transcriptional regulator dTIS11.”

_______________________

تحديث: 

وجدت هذا الموقع (AREsite2):

http://nibiru.tbi.univie.ac.at/AREsite2/welcome

فيما يخص AREScore، وهو موقع مُحدث أكثر، ويشمل مواقع أكثر من 3′-UTR، وأيضا AU, GU and U-rich elements. وفي النتائج يعطي الأبحاث التي درست هذه المنطقة في الجين (رابط يحولك لـ Pubmed). تم تطوير الموقع من باحثين مختلفين، من جامعة فينا في النمسا. وطبعا، أفضل من السابق ذكره بكثير وبدون مقارنة.

للمهتمين، هذه المراجع:

Research article: https://doi.org/10.1038/s41598-018-23551-8

The role of AUF1 in regulated mRNA decay: https://doi.org/10.1002/wrna.26

Genome-Wide Assessment of AU-Rich Elements by the AREScore Algorithm:

10.1371/journal.pgen.1002433

AREsite2: an enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements: https://doi.org/10.1093/nar/gkv1238