ATHEER

بسم الله الرحمن الرحيم

بإذن الله في هذه التدوينة سأتحدث عن كيفية التعامل مع النظام المرافق لجهاز QuantStudio 3 Real-Time PCR، الجهاز اللي عملت عليه كان هذا:

Software v1.5.0

في البداية، غالبا لن يستفيد من هذه التدوينة إلا اللي من يعىف فكرة عمل الـ RT-qPCR -سأشرحها بشكل بسيط جدا-، ومن عنده هذا الجهاز في المعمل. وطبعا أنصحكم أولًا بتحميل الـ software على أجهزتكم الشخصية حتى تطبقون عليه بأريحية. ممكن تحميله من هنا:

الجهاز يعتبر من أحدث أجهزة الـ RT-PCR ومن أفضلها حسب تجارب كثير من الباحثين في المعمل، ومع ذكر خواص الجهاز سيتضح لكم السبب.

بعد فتح البرنامج، لو لديك ملف سابق استخرجته من الجهاز ممكن تفتحه، أو نضغط Creat New Experiment.

Instrument type: الجهاز اللي عندنا كان QuantStudio^TM3 System.

Block type: Depend on the type of plate you use.

-> When we were working on it and use 0.1-mL Block, a warning appears on the instrument says: QuantStudio^TM3 System only matches with 96-Well 0.2-mL Block. However, the instructions on the handbook didn’t say that, use 0.2mL to avoid that anyway!

Experiment type: هنا منبع الإبداع في هذا الجهاز، كثير تجارب ممكن تتسوى فيه، وحتى تقدر تصمم تجربتك الخاصة! في الكتاب اللي يجي مع الجهاز -وممكن تحمله من الموقع، راح أرفقه بالأخير- مشروحة .كل تجربة وكيف ممكن تسويها وايش تحتاج

اشتغلت فقط على Comparative Ct، وهي اللي بستفيض بشرحها إن شاء الله.

Chemistry: يعتمد على نوع الـ Primers الخاصة فيك، هل هي مصممة لتتماشى مع نوع SYBR® Green أم TaqMan ® Reagents. فيديو جميل يشرح الفرق بينهم :

__________________________________________________

الآن، لو نوع التجربة لديك هو: (Comparative Ct (∆∆Ct، فالآن راح نتكلم فيها باستفاضة أكبر قبل الإنتقال للجزئية التالية:

الهدف الرئيسي منها هو المقارنة بين التعبير الجيني (مستوى الـ mRNA) للجين/ـات مقارنة بمرجع جيني واحد.

كيف؟ وماهو المرجع الجيني (Reference gene)؟ *يسمى أيضا (House-keeping gene)*

لنفترض أن عندنا الجين P53 ونحب نعرف هل ارتفع التعبير الجيني له في الخلايا السرطانية (ب) أم لا.

وقتها لازم تكون عيناتي:

-خلايا سرطانية (ب) أضع معها البرايمر الخاص بجين P53.

-خلايا طبيعية من نفس المريض مع برايمر P53 حتى أعرف مستوى الجين فيها، وأقارنهم ببعض (عينة مرجعية).

-خلايا سرطانية (ب) أضع معها البرايمر الخاص بـ Reference gene وهو عبارة عن جين يحدث له تعبير (expression) في كل أنواع الخلايا وبنفس المستوى تقريبا، والتعبير الجيني له ما يتأثر بأي حال (حتى كون الخلية سرطانية، ما يأثر على مستوى التعبير الجيني له).

-خلايا طبيعية من نفس المريض مع البرايمر الخاص بالـ Reference gene.

عادة يكون الـجين المرجعي إما: GAPDH or b-Actin.

طبعا الجهاز بيحسب عدد الـ mRNA لكل الجينات المحددة في العينات الأربع، ويقارنهم ببعض، ووقتها يعطيك النتيجة: هل الـ P53 كان مرتفع في الخلايا السرطانية مقارنة بالخلايا الطبيعية (كلها تعتمد على مستوى الـ Reference gene). الفكرة مب معقدة أبدا، لكن من الصعب شرحها بالكلمات، لذلك هذا الفيديو قد يساعد:

والـ HandBook اللي بضيفه بالأخير بيساعدكم أكثر وبشكل أفضل وأوضح.

_______________________________________________

ننتقل الآن لقسم الـ Method:

في هذا القسم اتبعوا البروتوكول الخاص فيكم بدقة، ولاتنسوا تغيير القيمة في خانة الـ Volume “كثير ينسونها وهي مهمة جدا”.

أولا، الـ Hold stage، أدخلوا درجة الحرار والزمن. وغالبا تكون خطوة وحدة.

في الـ PCR stage، مهم نتطرق للرموز الموجودة:

رمز الكاميرا: يعني أنه خلال هذه الخطوة سيتم تسجيل البيانات، نحتاجها فقط في الخطوة الثانية (Annealing step).

رمز الإعدادات: لو ضغطتوا عليه راح تنفتح أيقونة فيها الخيارات التالية:

أحسن شيء في هذا الجهاز هو خيار الـ VeriFlex

كما نعرف، الـ Annealing يحصل عند درجة حرارة مختلفة من برايمر لآخر، حسب تصميمنا للبرايمر، وحسب ظروف المعمل اللي نشتغل فيه، وعادة نحتاج نسوي optemaization للبرايمر حتى نعرف عند أي درجة حرارة يسوي Annealing -حتى لو كنا مصممينه بشكل جيد، ضروري نتأكد بالمعمل-.

وبما أننا نستخدم 96-Well plate فنقدر نسوي أكثر من عينة وأكثر من برايمر في نفس الـ plate، للأسف، الأجهزة القديمة ما تقدر تشتغل إلا على درجة حرارة Annealing وحدة، وبالتالي نضطر نسوي برايمر واحد كل مرة، ونخسر plates ووقت.

خيار الـ VeriFlex هنا يسمح لنا بوضع أكثر من درجة حرارة Annealing ! ثلاث درجات حرارة كحد أقصى.

لو تلاحظون، مكتوب 1-4، 5-9،8-12، وهذا يعني أن الـ Wells من 1-4 (First zone) تمشي عليها درجة حرارة واحدة، ومن 5-8 (Second zone) درجة حرارة ثانية، ومن 9-12 (Third zone) درجة حرارة ثالثة، بشرط ألا يتجاوز الفرق بين درجة حرارة الـ Zones المتجاور 5 درجات. WOW

نجي للـ Auto Delta:

هذا الخيار يسمح لك بتغيير درجة الحرارة بعد مدة معينة، مثلا بعد الـ cycle الـ 20، ممكن تزيد أو تنقص درجة الحرارة -بحدود مذكورة بالصورة- وأيضا ممكن تغير بالوقت.

طبعا هذه الحركة ممكن تساعدنا نسوي touch-down بحيث نمرر أكثر من درجة حرارة على العينة.

ننتقل الآن للـ Melt-Curve Stage:

في حال ما كنت ترغب بالإحتفاظ بالعينة، فهذه المرحلة مهمة جدا جدا جدا -حتى لو ما ذكرت في البروتوكول الخاص فيك- ضروري إضافتها بالأخير، لأنها راح تعطيني نتائج الـ Melting Curve واللي بواسطتها أعرف هل عينتي نقية أم فيها Contamination or primer-dimer ؟ وبدون هذه النتيجة، ماراح أبدا تتأكد  بثقة من دقة وسلامة نتائجك.

أنا أخلي إعداداتها كما هي دون تغيير.

إذا انتهيت لاتنسى تضغط Save حتى مايروح شغلك. والآن ننتقل للقسم الثالث.

________________________________________

قسم الـ Plate:

هنا نبدأ نكتب بيانات كل well عشان يقرأها لنا ويحللها، هذا القسم مرن وممكن تغير البيانات المُسجلة فيه حتى بعدما تطلع النتائج.

أنا أحب أشتغل على خانة الـ  Advanced Setup لأنها أكثر مرونة وأسهل، لكن نشرح الواجهة هذه أولا.

حدد المربعات اللي لها نفس العينة -> خيار الـ sample اكتب فيه اسم الخلايا -> خيار الـ Target اكتب فيه اسم الجين المستهدف.

بالنسبة للـ Passive Reference: هي عبارة عن صبغة غالبا تكون مضافة مع الـ Master Mix –اقرأ محتويات الـ master mix، وغالبا راح يكتبون لك وش نوع الـ Passive dye المضافة، في وضعنا كانت ROX-. هي عبارة عن dye تعطي flurecence طول وقت التفاعل، ما تتأثر بأي عامل ثاني، فلو طلعت النتائج ولقيت أن الـ Passive reference ما تعطي flurecence منظم، بل متذبذب، هذا يعني أن الـ Master mix الخاص فيك فيه مشكلة، وبالتالي ضروري تغيره.

لو كانت شغالة صح فالمفترض تعطي plot كذا:

لاحظوا كيف الـ ROX يعطي خط منتظم، لو كان متذبذب فالنتائج غير صالحة ولازم نغير الـ Reagents.

نرجع لقائمة البيانات:

Reference Sample: طالما أن تجربتنها هي (Comparative Ct (∆∆Ct، فهذا يعني أن وجود عينة تُقارن النتائج بها، ففي مثال الخلايا السرطانية، الخلايا الطبيعية هي الـ reference sample.

Endogenous Control: هو الـ Reference gene or house-keeping gene.

الآن، نلاحظ في الأسفل وجود أيقونتين زرقاء ورمادية:

U= unknown

N= negative control= well that contains everything except cDNA sample. add nucleases-free water instead of it. VERY IMPORTANT.

كل well راح تحدد الـ Task الخاصة فيه، هل هو N أم U، وهذا موجود في الـ Advanced Setup، مثل ما هو واضح:

الشكل النهائي يفترض يكون كالتالي -من ناحية ملئ الفراغات-:

أخيرا Save، وبسم الله يبدأ الـ Run.

________________________________

بالنسبة للنتائج، وتحليلها، هذه قصة أخرى، في تدوينة أخرى، في وقت آخر، إن شاء الله.

________________________________

هنا مراجع مفيدة، ومفيدة بشكل خيالي، ولازم لازم لو ناوي تشتغل على الجهاز تقرأها بتركيز، وفيها أيضا Troubleshooting ترجع لها:

Real-time PCR handbook:  https://www.gene-quantification.de/real-time-pcr-handbook-life-technologies-update-flr.pdf

QuantStudio™Design and Analysis Desktop Software- USER GUIDE: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010408_QuantStudioDesign_Analysis_Desktop_Software_UG.pdf

(هذا المرجع يشرح النظام كاملا بكل الاستخدامات، وغالب الأشياء اللي تعلمتها اكتشفتها من هنا، قرأتها واجبة).